（一）载体构建阶段
克隆失败原因
酶切不完全：
避坑：优化双酶切条件，纯化后电泳验证片段大小 。
案例：插入片段与载体连接效率低时，需重新设计引物或更换酶切位点 。
连接效率低：
优化：控制插入片段与载体摩尔比，延长连接时间。
假阳性克隆：
验证：必须通过菌落 PCR 和测序确认插入片段。
Gateway兼容载体
L4440-Gateway 在 EcoRV 位点插入重组盒，可通过 BP/LR 反应快速克隆，避免传统酶切-连接 ：
展开剩余83%优势：简化克隆流程，适合高通量筛选。
注意：需在 PCR 引物中引入 attB 位点 。
（二）细菌转化与诱导
感受态细胞制备
关键步骤：
使用 CaCl₂法 制备 HT115 感受态细胞，冰浴 30 min 。
热激温度 42℃/90秒。
复苏后涂布含 Amp（100 μg/mL） + Tet（12.5 μg/mL） 的 LB 平板 。
试剂信息
英文名称：L4440 Vector
载体用途： 线虫RNAi干扰载体
载体大小： 2790bp
原核抗性： 氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）
克隆菌株： DH5α
启动子： T7
复制子： pUC
质粒标签：lacZN, OriF1
表达宿主：线虫
诱导方式： IPTG
5'测序引物： 根据全序列设计
纯度：≥95%
储存条件：-20℃避光干燥
生产厂商：西安强化生物科技
&基本结构与设计原理（一）
载体骨架：L4440是pBluescript质粒的改造版本，长度约2790 bp，属于高拷贝数质粒。
核心元件：
反向T7启动子：位于多克隆位点两侧，驱动DNA双链同时转录，生成互补RNA形成dsRNA。
多克隆位点（MCS） ：185 bp区域，含多种限制性酶切位点，用于插入目标基因片段。
筛选标记：氨苄青霉素抗性基因，用于细菌转化后的阳性克隆筛选。
复制起点（ori） ：支持高拷贝复制。
升级版本：新版本在T7启动子上游添加终止子，减少非特异性转录。
（二）功能机制
dsRNA生成：目标基因插入MCS后，在IPTG诱导下，宿主菌的T7 RNA聚合酶从两侧启动子转录，生成互补RNA链并形成dsRNA。
RNAi干扰原理：线虫摄食含dsRNA的细菌后，dsRNA通过肠道吸收，触发RNAi通路沉默目标基因表达。
&相关试剂Carboxy-PTIO(cPTIO)
Tide Fluor 7叠氮化物
BXQ-1 CPG (1000 A)
AzoDye-3 CPG (500 A)
Azo Dye-3 PEG 10 炔烃
MitoTEMPOL线粒体靶向SOD模拟物
AP219 (Control Compound for AP39)
PE-iFluor 594 Tandem PE-iFluor 594
PE [R-Phycoerythrin] CAS 11016-17-4 PE
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator
Rosetta-gami 2(DE3) Chemically Competent Cell
TOP10 Electrocompetent cell 大肠杆菌电转感受态细胞
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本试剂用于科研领域，其他用途概不适用！
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